Variabilidade genética e fenotípica de Pseudomonas syringae pv. actinidiae, agente causal do cancro da actinídea, na região do Entre Douro e Minho

Abstract

A bactéria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), agente causal do cancro bacteriano da actinídea, é responsável pela doença considerada mais grave desta cultura na atualidade, provocando importantes prejuízos nos principais países produtores de kiwi, incluindo Portugal. Esta doença, descrita pela primeira vez no Japão em 1984, foi detetada em Portugal em 2010, manifestando elevada agressividade e uma dispersão muito rápida, tendo, nos dias de hoje, distribuição generalizada nas principais regiões produtoras de kiwi. Este trabalho, realizado em 2013 e 2014, teve por objetivo isolar, identificar e caraterizar isolados de Psa na Região do Entre Douro e Minho (EDM), e conhecer a prevalência das populações de Psa (Psa1, Psa2, Psa3, Psa4) nesta região. A partir de material vegetal com sintomas da doença proveniente de diferentes pomares de Actinidia deliciosa, isolou-se o agente patogénico e realizou-se a sua identificação, caracterização morfológica, fenotípica, molecular e de patogenicidade. A análise fenotípica de 94 características de uma coleção de isolados portugueses mostrou que a maioria deles se posicionou em dois fena. A maior parte dos isolados ficou incluído no fenon 1 juntamente com a estirpe italiana CFBP 7286 (Psa3). A comparação destes resultados com a identificação molecular obtida por PCR (com os primers Psa-F1/PsaR2, de Rees-George e colaboradores (2010)) permitiu identificar as 23 estirpes portuguesas como Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Os resultados da análise da estrutura genética da população portuguesa de Psa caracterizada, com a utilização da técnica de multiplex-PCR utilizando os primers PsaF/PsaR, EuropeF/EuropR, ChinaF/ChinaR e JapanF/JapanR, amplificou os dois fragmentos de ADN esperados de 311 e 733 pb simultaneamente, em 22 estirpes isoladas na região EDM e na estirpe italiana CFBP 7286. Estes resultados indicam que as estirpes portuguesas pertencem à população Psa3, população mais virulenta de Psa, atualmente responsável pelo surto da doença na Europa e na Nova Zelândia. Apenas para uma estirpe (B65), a caracterização molecular não foi conclusiva, indicando os resultados que se poderá tratar de uma estirpe da população Psa4 (P. s. pv. actinidifoliorum pv. nov.). A análise do polimorfismo obtido por RFLP e BOX-PCR permitiu confirmar que, com exceção da estirpe B65, as estirpes portuguesas são idênticas à população Psa3, pois apresentaram o mesmo perfil genético das estirpes Psa3 italiana e da Nova Zelândia incluídas neste estudo. Contudo registou-se a existência de variabilidade genética no interior das estirpes da população portuguesa. Estes resultados foram igualmente confirmados pela análise dos alinhamentos das sequências dos genes ompP1 e cts das estirpes portuguesas estudadas, que permitiu observar que existe similaridade entre estas e as estirpes de Psa da população Psa3, cujas sequências foram obtidas no GenBank (JX297572) e no artigo publicado por Vanneste e colaboradores (2010), respetivamente. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram ainda isolar bacteriófagos naturalmente presentes em pomares de actinídea do EDM, com a capacidade de provocar lise celular de estirpes de Psa. Estes resultados promissores, são importantes do ponto de vista do controlo da doença, sendo necessário a realização de novos estudos.

The bacteria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), the causal agent of bacterial canker of kiwifruit, is currently the cause of the most severe disease affecting this crop, causing significant losses in the main kiwi producing countries, including Portugal. This disease was described by the first time in Japan in 1984 and it was detected in Portugal in 2010, showing high aggressiveness and very fast spreading, and at the moment it is present in all the main areas of kiwifruit production. This study, accomplished between 2013 and 2014, aims to isolate, identify and characterize strains of Psa in the Entre Douro e Minho (EDM) region, and to determine the prevalence of populations of Psa (PSA1, PSA2 Psa3 and PSA4) in this region. The pathogen was isolated from plant material with symptoms of the disease from different Actinidia deliciosa orchards and then was realized its identification and morphological, phenotypical, molecular and pathogenicity characterization. The Phenotypic analysis of 94 characteristics of Portuguese isolates collection showed that the majority of them are positioned in two fena. The majority of the isolates were included in fenon 1 with the Italian strain CFBP 7286 (Psa3). The comparison of these results with the molecular identification obtained by PCR (with the primers Psa-F1/PsaR2, Rees-George et al. (2010)) allowed the identification of 23 Portuguese strains as Pseudomonas syringae pv. actinidiae. The results of the analysis of the genetic structure of the Portuguese Psa population, obtained trough the multiplex-PCR technique using the primers PsaF/PsaR, EuropeF/EuropR, ChinaF/ChinaR and JapanF/JapanR amplified the two expected DNA fragments with 311 and 733 bp (bar pares) into 22 strains isolated in EDM region and into the Italian strain CFBP 7286 (Psa3). These results indicate that the Portuguese strains belong to the Psa3 population, the most virulent Psa population, currently responsible for the European and New Zealand Psa outbreak. The molecular characterization was not conclusive in just one strain (B65), with the results showing the possibility that this strain belongs to the Psa4 population (P. s. pv. actinidifoliorum pv. nov.). The polymorphism analysis obtained by RFLP and BOXPCR allowed to confirm that the Portuguese strains (except the strain B65) are identical to the Psa3 popultaion, because they exhibited the same genetic profile as the Italian and New Zealand Psa3 strains included in this study. However, it was observed that there is genetic variability between Portuguese population strains. These results were also confirmed by the analyses of the ompP1 and cts gene sequences of the EDM strains studied, which allowed the observation of similarity between this Portuguese strains and the Psa strains of the Psa3 population, whose sequences were obtained respectively from the GenBank (JX297572) and the article published by Vanneste and Colaborators (2010). The results of this work allowed the isolation of bacteriophages naturally present in EDM Actinidia orchads, with the ability to cause cell lysis of Psa strains. These promising results are important for disease control, being necessary to conduct further studies.